간장에서 분리한 Bacillus licheniformis가 생산하는 박테리오신의 특성 및 정제

Abstract

수집한 간장시료에서 형태학적인 특성에 따라 상이한 30주의 미생물을 분리하고 MRS 액체배지에서 37oC, 24시간 배양한 후 회수한 배양 상등액 중 paper disc법으로 항균활성이 있는 것을 일차 선별하여 proteinase K 처리에 의해 항균활성이 사라지는 시료 하나를 최종적으로 선별하였다. 선별한 분리주를 생화학적 분류와 분자계통학적 분류를 통해 동정한 결과 B. licheniformis로 나타났다. 이 균주의 생장온도와 배지의 초기 pH에 따른 세포생장 및 박테리오신 활성을 조사한 결과 배양온도는 37oC, 배지의 초기 pH는 7.0에서 박테리오신의 활성이 가장 높게 나타났다. B. licheniformis가 생산하는 박테리오신은 Bacillus sphaericus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Micrococcus luteus, Paenibacillus polymyxa 및 Pediococcus dextrinicus 등에 대해서 항균활성을 보였으며, pH 3.0～11.0에 이르는 거의 전 pH 영역에서 20시간 이상 처리하여도 그 항균활성을 완전히 잃지 않아 비교적 넓은 pH 범위 내에서 안정함을 알 수 있었다. Acetone, acetonitrile, chloroform, ethanol 처리 및 20～100oC에서 60분간 가열 시에도 높은 항균활성을 유지하였다. 여러 가수분해효소에 대한 내성을 조사한 결과 trypsin, α-chymotrypsin, pepsin, α-amylase 및 carboxypeptidase A 등은 항균활성에 영향을 주지 않았으나 lipase는 항균활성을 약간 감소시켰으며 proteinase K는 항균활성을 완전히 사라지게 하였다. 75% 황산암모늄 침전, 양이온교환크로마토그래피, 역상 HPLC 등의 과정을 통해 정제된 박테리오신의 상대비활성(specific activity)은 배양상등액에서 보다 약 75배 증가하였고 회수율은 13.5%였다. 역상 HPLC를 통해서 정제된 박테리오신의 분자량을 tricine SDS-PAGE을 통해서 확인한 결과 약 2.5 kDa으로 나타났으며 염색 시 단일 band로 나타나 순수하게 정제되었음을 확인하였다.